Il nuovo museo si trova in Corso Rossellino al secondo piano dell'attuale Palazzo Vescovile e contiene una delle raccolte più prestigiose del territorio della provincia senese. Esso nasce dal nucleo del già ricchissimo Museo della Cattedrale, integrato da numerose opere provenienti da altre chiese pientine e dintorni.
Fra le tavole trecentesche di rilievo sono la Madonna col bambino di Pietro Lorenzetti proveniente dalla pieve dei Santi Leonardo e Cristoforo a Monticchiello; un'altra Madonna col bambino è quella di Ugolino di Nerio che viene dalla chiesa di San Lorenzo a Monterongriffoli; straordinaria la grande tavola della Madonna della Misericordia del 1364 di Bartolo di Fredi.
La pittura senese del quattrocento è rappresentata dalla notevole tavola del Vecchietta con la Madonna in trono fra i Santi Biagio, Giovanni Battista, Nicola e Floriano, che si dimostra aggiornato alle nuove tendenze fiorentine per quanto riguarda la luminosità e la prospettiva.
Databile ai primi anni del cinquecento è la Madonna della Misericordia riferita a Luca Signorelli.